Gene Mutation and Expression of Human Esophageal Cancer in Relation with Betel Quid Chewing

摘要

    台灣本土的公共衛生研究發現，台灣2100萬人口中，約200萬人是現在或曾經嚼食檳榔的紅唇族；在南台灣一般平地人盛行率為10%，而南部原住民檳榔嚼食率約為42%。自1960年代到現在，在動物實驗或人類的研究報告，檳榔都是一種強力的致癌物；它可導致口腔癌、食道癌、甚至胃癌等。其中以口腔癌的研究最多，有關檳榔與食道癌的研究並不多。
本研究針對一直位居我國惡性腫瘤前十名內的食道癌進行研究。分別由蛋白質層次，DNA及RNA層次來探討在腫瘤癌化過程中扮演重要角色的致癌基因(k-ras，c-met)及抑制癌基因(p53)變異情形；在食道癌病人，Barrett’s食道疾患及正常對照組之間有無嚼食檳榔? 其表現如何? 分析在食道癌癌化過程中檳榔的角色又是如何？
    針對以上目標，本研究分3年共取120名食道癌病人，Barrett’s食道疾患及120正常人經內視鏡檢查或開刀證實者; 在內視鏡檢查時切片取其食道癌組織及週邊正常組織應用PCR/SSCP/Sequencing來測定食道癌或正常組織中p53及K-ras的變異情形，同時也應用美國羅氏公司LightCycler聚合脢連鎖反應儀同步定量RT-PCR產物，分析組織中c-met基因表現的情形; 並比較管灌餵食、檳榔、菸、酒與食道癌之相關性。本研究第4-5年根據子計劃(一)相關代謝基因多型性研究的結果及子計劃(九)的細胞株及子計劃(十)的老鼠動物實驗後, 以不同劑量，不同成份檳榔作管灌餵食或口服餵食, 比較實驗結果，進行基因晶片分析，電腦統計分群後得到的檳榔相關性基因的改變，再應用到原先的食道癌組織及正常食道組織中，分析並驗證體外研究的結果。
    我們預期嚼食檳榔的食道癌病人腫瘤組織會有不同程度的致癌基因及抑癌基因的變化，我們也期望能配合臨床資料及問卷結果，統計分析這些情況包括癌侵犯度、分期、預後等與檳榔嚼食、抽煙、酗酒等情形是否相關。 經由本計劃，我們可以了解台灣食道癌病人k-ras、c-met及p53基因的變化，而且經由代謝基因變異的發現及癌細胞株與老鼠實驗中，由測定加入檳榔素前後的各個時間點，各群基因表現的情形，並比較分析其與檳榔各成份劑量之相關性。且反過來在人類食道癌組織中加以印證，將可使我們進一步了解檳榔、煙、酒對食道癌的影響及其與臨床上腫瘤惡性度的相關，並提供將來研究和治療的新策略。

一、研究背景

    嚼食檳榔在印度及東南亞國家是一個非常流行的嗜好。台灣地區嚼食檳榔的人數逐漸增多且有年輕化，職業雜異化和都市化的驅勢(1)。本院公衛學科曾報告嚼食檳榔的盛行率，在台灣2100萬人口中，約有200萬人現在是或曾經是嚼食檳榔的紅唇族。而在一般平地人盛行率大約為10%，以高雄市居民而言約6%現在正嚼食檳榔，有4%曾經嚼食檳榔，但是山地人則較高; 北部原住民嚼食率約15%而15歲以上南部原住民(包括:排灣、魯凱、布農族)嚼食檳榔的盛行率更高達42%。所以就台灣本島而言，嚼食率以南部較高，山地原住民更高。嚼食檳榔在南台灣確實是個嚴重問題。
   有關檳榔致癌性之動物實驗的報告非常多，Muir & Kirk(1960) 以檳榔嚼塊與菸草的萃取液每天塗抹在12隻Swiss mice 的耳朵，兩年後發現2/12有鱗狀上皮癌1/12有鱗狀乳頭腫;  1976年Ranadive(5)以熱水和冷水萃取之檳榔成分，打入Swiss mice之皮下組織中，每星期打一次，共六星期，結果有50%-70%的老鼠在注射處產生纖維細胞癌。1984年Dr. Wenke(6)等人的動物實驗中以檳榔汁內的3-(methylnitrosamino)propionitrile(MNPN)以皮下注射方式打到老鼠體內發現11/30老鼠發生舌癌，21/30老鼠發生口腔癌，27/30老鼠發生食道癌。
    至於檳榔對人體致癌性的研究，在1991年印度的一篇研究也發現當嚼食檳榔超過40年的人得到食道癌的機率是不吃檳榔人士的2.03倍，1995年高醫報告更指出在台灣嚼食檳榔與口腔癌間為有意義的相關，而且當合併有抽煙、喝酒時得到口腔癌的機率為一般人的123倍;  在人類頰黏膜與嚼食檳榔的研究上發現檳榔產生物鹼(arecoline 與 arecaidine)會促進細胞增殖。1994年郭等人以PCR及DNA序列分析的方法，來分析台灣口腔上皮細胞癌檢體K-ras癌基因codon 12突變的情形，在33個檢體中有6例(18%)發生K-ras 的點突變，而印度Saranath則報告在印度這個嚼食檳榔流行率高的國家，口腔癌有H-ras點突變的比率高達35%；這顯示檳榔與這些活化的ras癌基因有密切的關係。
    蛋白質酪胺酸(tyrosine kinase protein)活化酵素是人體內主要的致癌基因。在許多的細胞控制機轉，比如細胞生長、移動、黏著以及惡性轉化上，都扮演重要的角色。表皮生長因子受體和 ErbB2 (c-erbB2, HER2/neu)是其中最好的例子。 c-met之產物為酪胺酸活化酵素之一員，有一個橫貫細胞膜的區域。它的配合基是肝細胞生長因子 (hepatocyte growth factor/scatter factor, HGF/SF)。HGF/SF-Met相關的訊息傳導在細胞生長、移動、上皮生成和胚胎形成等扮演重要的角色。此外，HGF/SF-Met相關的訊息傳導在致癌過程中也扮演重要的角色。
已知過量c-met基因表現與腫瘤的轉移密切相關， 在部份癌症病患也會有較差的存活機會。比如乳癌、膽道癌症、胃癌、子宮內膜癌、肝癌、大腸癌和腎臟細胞癌等。

    食道癌之組織型態及解剖學位置分佈，以鱗狀上皮細胞癌及中間三分之一佔最多。地理分佈分析顯示台灣之東部地區及山地鄉，有較高的食道癌發生率，國際比較及移民研究顯示，華人及黑人是罹患食道癌的高危險群。

    中國人罹患食道癌的比率相當高，根據行政院衛生署統計台灣地區歷年十大死亡原因中，惡性腫瘤自民國71年起一直高居首位，而自民國67年以來食道癌一直都維持在惡性腫瘤的前十名內，高醫胃腸內科於民國80年在國科會的專題研究(NSC-80-0412-B037-044) 補助下曾對66例食道癌病人腫瘤細胞染色以流式細胞分析儀(Flow Cytometry)測定DNA套數，DNA index，並與臨床及病理資料，存活率之關係作分析，結果發現DNA含量為雙套的腫瘤大部分屬於分化良好的一群，平均存活天數為327天而非雙套的腫瘤大部分屬於分化不良的一群，平均存活天數僅只277天(12)。
其實自1960年代到現在，國內外的研究陸陸續續指出，不管在動物實驗或人類的觀察報告，檳榔都是一種強力的致癌物；它可導致口腔癌、食道癌、甚至胃癌等(13)。其中以口腔癌的研究最多，而有關食道癌與檳榔的研究並不多。
    國立台灣大學(台灣)流行病學研究所徐婉倫的碩士論文提及：以世代追蹤研究探討台灣食道癌之多重危險因子，研究對象包含台北市南港區、高雄市楠梓區、台北縣三芝鄉、桃園縣大園鄉、新竹縣關西鎮、新埔鎮、橫山鄉、竹東鎮、苗栗縣竹南鎮、雲林縣斗南鎮、嘉義縣朴子鎮、高雄縣大樹鄉、屏東縣竹田鄉、車城鄉、高樹鄉、宜蘭縣員山鄉、澎湖縣馬公市、湖西鄉及白沙鄉等19鄉鎮市區之25245名30歲以上男性居民，追蹤8-15年後，共有44名食道癌新病例發生。

    利用Cox氏比例危害模式估計各危險因子的相對危險性及95％信賴區間，研究結果顯示在調整年齡、教育程度、氏族及其他危險因子後，累積抽菸量超過20包 / 年、有喝酒習慣及食用醱酵類食品頻率較高者（≧9餐?週）者，都會增加罹患食道癌的危險性；食用黃綠色蔬菜頻率與食道癌無顯著相關。以累積抽菸量小於或等於20包 / 年而且無喝酒及嚼檳榔習慣為參考組時，比較累積抽菸量大於每年20包而且又有喝酒和嚼檳榔習慣者，發生食道癌的多變項調整後相對危險性高達21.3倍（95％信賴區間為 4.3-106.5）。

二、緣由 ( 略過 )
三、目的與重要性

藉由本研究，我們預期可以釐清下列的問題：
1. Barrett’s食道症這個癌前病變和端粒脢表現情形及端粒脢相關mRNA (hTR，hTERT)的量是否相關?
2. 食道癌病人，藉由RNA level的hTR、hTERT的測定配合蛋白質level的端粒脢活性的測定並評估其與病人臨床的分期、遠端轉移情形及預後的關係，和檳榔、煙、酒的相關性又是如何?
3. 癌細胞株研究，以檳榔素分別加入三株食道癌細胞株及二株胃癌細胞株中，並觀察加入檳榔素前後的各個時間點，端粒脢及端粒脢相關RNA(hTR，hTERT)表現的情形，並比較分析其與檳榔素劑量之相關性。可以再次的驗證檳榔在食道癌癌化過程中所扮演的角色。

    本研究將有助於釐清檳榔在食道癌癌化過程中所扮演的角色，而且也會進一步瞭解端粒脢及端粒脢相關mRNA (hTR，hTERT)的作用，這將有助於將來食道癌的研究甚至基因治療的依據。

四、參考文獻 ( 略過 )
 

研究方法、進行步驟及執行進度

  不同濃度的板模所需達到反應平原的週期數不同。板模濃度越低，要達到反應平原的週期數越多。於實時PCR中，一般行40週期的擴增。

   To: Real-time PCR !!